Lipoproteínas y vesículas extracelulares: impacto directo en los resultados

Las vesículas extracelulares (EVs) transportan proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, por lo que son de enorme interés como fuentes de biomarcadores y mediadores de comunicación intercelular. Sin embargo, cuando el análisis se realiza en suero o plasma, nos enfrentamos a un problema durante años infravalorado: la contaminación por lipoproteínas.

La dificultad no es trivial. Lipoproteínas y EVs comparten propiedades físicas (tamaño, densidad y composición lipídica) lo que provoca que co-aíslen utilizando la mayoría de los métodos estándar. ¿Consecuencia? muchos resultados atribuidos a EVs pueden estar parcial o incluso mayoritariamente influenciados por lipoproteínas, comprometiendo la interpretación biológica de los datos (1,2).

Reconocer y abordar este problema no es un detalle técnico: es un requisito esencial para obtener resultados fiables y reproducibles.

En sangre circulan distintos tipos de lipoproteínas con tamaños que abarcan desde ~5 nm hasta más de 1 000 nm. Este rango se solapa ampliamente con el de las EVs, típicamente descritas entre 30 y 1 000 nm (3,4).

La diferencia clave, y aquí empieza el verdadero problema, es cuantitativa. Las lipoproteínas son varios órdenes de magnitud más abundantes que las EVs en plasma. Se estima que el número de partículas lipoproteicas puede superar al de EVs entre 20 y 100 veces, especialmente en el caso de HDL (4). En este contexto, técnicas basadas en el recuento de partículas simplemente detectan “lo que más hay”.

Diversos estudios han demostrado que métodos ampliamente, utilizados como la ultracentrifugación diferencial, los gradientes de densidad o la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), no separan eficazmente EVs de lipoproteínas (3,5). Incluso se ha demostrado que partículas de LDL co-purificadas presentan tamaños y comportamientos prácticamente indistinguibles de EVs, reaccionando incluso con anticuerpos utilizados habitualmente como marcadores de vesículas (1). Este fenómeno genera una falsa sensación de especificidad: lo que se interpreta como una señal EV puede corresponder, en realidad, a lipoproteínas disfrazadas de vesículas.

Las lipoproteínas tienen un impacto directo en técnicas analíticas:

1. Conteo y distribución de tamaño
Técnicas como Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) o TRPS no distinguen entre EVs y lipoproteínas. Como resultado, los recuentos de partículas suelen estar inflados y las distribuciones de tamaño distorsionadas, especialmente en muestras ricas en HDL (5).

2. Análisis proteómico
La presencia de apolipoproteínas, particularmente ApoA1 y ApoB, altera de forma significativa los perfiles proteómicos obtenidos a partir de preparaciones de EVs, enmascarando proteínas de bajo nivel realmente asociadas a vesículas (4).

3. Estudios de RNA y miRNA
Las lipoproteínas también transportan RNA, incluyendo miRNAs. Estudios comparativos han demostrado que distintos métodos de aislamiento generan perfiles de miRNA muy diferentes, en gran parte debido a la co-purificación de lipoproteínas (6). Esto introduce un sesgo crítico en estudios de biomarcadores.

En estudios clínicos, este problema adquiere especial relevancia. Cambios observados en la “carga” de EVs o en su contenido molecular pueden reflejar variaciones en el metabolismo lipídico más que procesos patológicos relacionados con EVs (3, 5). Sin un control adecuado de las lipoproteínas, el riesgo de atribuir significado biológico a artefactos técnicos es considerable.

Estrategias para mitigar el problema

Combinación de métodos, como SEC seguida de gradientes de densidad, que reduce significativamente la contaminación lipoproteica frente a métodos únicos (4,7).
Técnicas avanzadas de fraccionamiento, como asymmetric flow field-flow fractionation (AF4), capaces de diferenciar subpoblaciones de nanopartículas con mayor resolución (8).
Usar las columnas DeLipo de SBI, elimina de forma eficaz las lipoproteínas contaminantes, sin comprometer la integridad de las EVs con solo un spin en la microcentrífuga.

Ninguna solución es perfecta, pero ignorar el problema ya no es una opción. Separar bien no es un lujo. Es la diferencia entre medir señal… o simplemente ruido bien vestido.

1.Sódar, B. W., et al. (2016). Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports, 6, 24316.

2.Simonsen, J. B. (2017). What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both? Circulation Research, 121(8), 920–922.

3.Yuana, Y., et al. (2014). Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles, 3, 23262.

4.Karimi, N., et al. (2018). Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences, 75, 2873–2886.

5.Mørk, M., et al. (2016). Particle size analysis of extracellular vesicles and lipoproteins in plasma using nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles, 5, 31638.

6.Buschmann, D., et al (2018). Evaluation of serum extracellular vesicle isolation methods for profiling miRNAs by next-generation sequencing. Journal of Extracellular Vesicles, 7(1), 1481321.

7.Lobb, R. J., et al. (2015). Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.Journal of Extracellular Vesicles, 4, 27031.

8.Zhang, H., et al. (2018). Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology, 20, 332–343.