Investigadores del Instituto de Tecnología de Massachusetts han desarrollado PASTE, una nueva herramienta CRISPR, que permite insertar fragmentos de ADN de gran tamaño en posiciones específicas.
La aproximación, denominada PASTE (de Adición Programable vía Elementos Diana Específicos de sitio, en sus siglas en inglés), facilita la introducción de secuencias de hasta 36 kilobases en el genoma sin generar puntos de rotura en las dos cadenas de ADN.
Con PASTE, los investigadores han cumplido su objetivo de dirigir la edición genómica hacia la posibilidad de reemplazar genes. Hasta el momento, la mayor parte de herramientas de edición estaban dirigidas a la inactivación de genes o corrección de mutaciones.
“Creemos que es un gran paso hacia conseguir el sueño de la inserción programable de ADN”, ha señalado Jonathan Gootenberg, investigador en el Instituto McGovern de Investigación Cerebral en el MIT. “Es una técnica que puede ser fácilmente adaptada tanto respecto al sitio donde queremos integrar como respecto a la carga”.
PASTE combina CRISPR con transcriptasa reversa e integrasas
La herramienta desarrollada por los investigadores combina un sistema CRISPR modificado con diversas enzimas que proporcionan las actividades necesarias para insertar grandes fragmentos de ADN.
El sistema CRISPR-Cas9 clásico consiste en una enzima Cas9 que corta ambas cadenas del ADN y un ARN guía que posiciona a la enzima en la localización deseada para el corte. Esta aproximación es muy útil cuando lo que se desea es inactivar un gen. Cas9 introduce un punto de rotura en el ADN que debe ser reparado por los mecanismos de reparación de la célula. Estos no son infalibles y durante el proceso se eliminan algunos nucleótidos, lo que puede llevar a inactivar el gen afectado. Otra posibilidad es añadir un ADN que actúe como molde para los mecanismos de reparación, en cuyo caso se puede corregir un error genético.
Frente al sistema clásico, el equipo del MIT quería desarrollar una herramienta para introducir fragmentos de ADN que no implicara cortes en ambas cadenas del ADN (lo que potencialmente puede derivar en reorganizaciones del material genético) y que permitiera cambiar un gen defectuoso por otro normal. Para ello, en primer lugar utilizaron una enzima Cas9 (combinada con un ARN guía) que en lugar de cortar las dos cadenas del ADN solo corta 1. En segundo lugar, los investigadores recurrieron a un tipo de enzima que utilizan los virus para integrar su genoma en el de las bacterias: las serina integrasas.
En la naturaleza, las serina integrasas reconocen secuencias específicas del genoma y facilitan la integración del ADN viral. Para su utilización en la herramienta PASTE, los investigadores analizaron las bases de datos metagenómicas disponibles e identificaron más de 25000 serina integrasas y sus correspondientes secuencias de destino. Su objetivo en este paso era detectar qué combinación de serina integrasa y secuencia de reconocimiento podría ser más efectiva para editar el genoma humano.
Finalmente, para completar PASTE, los investigadores fusionaron a Cas9 otro elemento más, dirigido a introducir las secuencias específicas necesarias para las integrasas: una transcriptasa reversa unida a un fragmento de ARN complementario a estas secuencias.
En conjunto, el sistema funciona de la siguiente forma: en primer lugar el ARN guía posiciona a Cas9 sobre la región de interés. Cas9 introduce un corte en una de las cadenas de ADN y a continuación, la enzima transcriptasa reversa, con ayuda del segundo ARN genera en ese punto una secuencia diana de integración para la serina integrasa. Finalmente, la serina integrasa introduce el fragmento de ADN que carga en el sitio de integración.
PASTE efectiva en diferentes células y un modelo animal
Los investigadores han demostrado la integración de fragmentos de diferentes tamaños en múltiples posiciones del genoma y tres tipos diferentes de células. De momento, el tamaño máximo de ADN integrado es de 36 kilobases, aunque el equipo cree que podría ampliarse.
En cuanto a su eficiencia , el equipo ha encontrado que en las líneas celulares alcanza un 50-60%, y en cultivos de células hepáticas o linfocitos T obtenidas del organismo alcanza un 5%. Además, también han obtenido resultados prometedores para su utilización in vivo, en ratones con un hígado humanizado. Este rendimiento es comparable o mejora al de otros sistemas de edición , con la ventaja de que puede ser utilizado en células que se dividen (a diferencia del CRISPR clásico) y genera menos modificaciones en posiciones no deseadas.
Un camino hacia el reemplazamiento de genes y el tratamiento de enfermedades
Desde el descubrimiento del sistema CRISPR como herramienta para introducir cambios en el genoma de forma específica han surgido múltiples modificaciones de la técnica para adaptarla a las diferentes necesidades.
Los resultados del trabajo, publicado en Nature Biotechnology, muestran a PASTE como una herramienta de gran interés tanto para la investigación como para el desarrollo de aproximaciones terapéuticas para enfermedades. Por una parte, la herramienta podría hacer posible reemplazar genes defectuosos como ocurre con la fibrosis quística. Por otra parte, podría facilitar la inserción de genes de interés en terapias celulares, como las terapias T-CAR.
“A través de proporcionar una eficiente y múltiple integración de transgenes en células en división y no en división y en modelos animales, la plataforma PASTE construye sobre los avances fundamentales en la biología de CRISPR y las integrasas para expandir el alcance de la edición del genoma y permitir nuevas aplicaciones en la biología básica y las terapias”, concluyen los investigadores.
En la actualidad el equipo busca nuevas formas de optimizar PASTE y evalúa su potencial para reemplazar la versión patológica del gen responsable de la fibrosis quística por una copia normal. De confirmarse su utilidad, la aproximación podría ser una oportunidad para otras enfermedades genéticas.
Amparo Tolosa, Genotipia
Imagen: Desde el descubrimiento de las herramientas CRISPR han surgido múltiples aproximaciones y aplicaciones derivadas. PASTE es la última de ellas. Imagen: Ernesto del Aguiila, National Human Genome Research Institute (www.genome.gov).
Artículo científico: Yarnall, M.T.N., Ioannidi, E.I., Schmitt-Ulms, C. et al. Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01527-4
Fuente: New CRISPR-based tool inserts large DNA sequences at desired sites in cells. https://mcgovern.mit.edu/2022/11/24/new-crispr-based-tool-inserts-large-dna-sequences-at-desired-sites-in-cells/
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