Debido a su sencillo y rápido procedimiento, los inmunoensayos ELISA son uno de los más utilizados en investigación y diagnóstico para la identificación y/o cuantificación de analitos de naturaleza proteica como péptidos, proteÃnas, anticuerpos y hormonas.
En función de la manera en que se produzcan las interacciones antÃgeno-anticuerpo, los ensayos ELISA pueden clasificarse en cuatro principales categorÃas.
Con esta entrada iniciamos una serie de 3 publicaciones donde os contaremos los detalles sobre los distintos tipos de ELISA, las diferencias entre ellos y las ventajas y desventajas de cada uno.
¡Empezamos!
Como ya hemos comentado en la introducción, en base al modo en el que se den las interacciones antÃgeno-anticuerpo, los ELISAs se clasifican en 4 tipos: ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA tipo sándwich y ELISA competitivo.
Veamos cada uno de estos tipos de ELISA con más detalle:
El ELISA directo es el ensayo ELISA más simple y rápido de todos, donde un anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá directamente al antÃgeno de interés permitiendo la detección y/o cuantificación del mismo.
El procedimiento simplificado serÃa el siguiente:
1º El antÃgeno se inmoviliza sobre una placa
2º Se añade un anticuerpo primario marcado con una enzima que se unirá al antÃgeno de interés
3º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antÃgeno de interés.
Es un ensayo parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar la señal obtenida. En este caso se utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario, y es este último el que irá conjugado a una enzima.
El procedimiento simplificado serÃa el siguiente:
1º El antÃgeno se inmoviliza sobre una placa
2º Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antÃgeno de interés
3º Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario
4º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antÃgeno de interés.
En el ELISA tipo sándwich el antÃgeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura y otro de detección también conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a dos epÃtopos distintos de un mismo antÃgeno.
El procedimiento simplificado serÃa el siguiente:
1º El anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la placa
2º Se añade la muestra que contiene el antÃgeno de interés que se unirá al anticuerpo de captura
3º Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antÃgeno unido a su vez al anticuerpo de captura.
4º En caso de que el anticuerpo de detección vaya conjugado a una enzima, procederemos directamente con el 5º paso. En caso contrario (que es lo más habitual en los ELISA tipo sándwich), será necesario añadir un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo de detección.
5º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antÃgeno de interés.
El ELISA competitivo es una variante más compleja de la técnica ELISA, también conocido como ELISA de inhibición debido al uso de un antÃgeno de referencia que competirá con el antÃgeno de la muestra por unirse al anticuerpo primario.
Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antÃgenos presentes en muy bajas cantidades.
El procedimiento simplificado serÃa el siguiente:
1º El antÃgeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
2º Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antÃgeno de interés, dando lugar a la formación de complejos antÃgeno-anticuerpo
3º Se añade la mezcla antÃgeno-anticuerpo a la placa, donde el antÃgeno de referencia competirá con el antÃgeno de la muestra por unirse al anticuerpo
4º Se lava la placa eliminando los complejos antÃgeno-anticuerpo solubles
5º Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario anclado al antÃgeno de referencia.
6º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que será inversamente proporcional a la cantidad de antÃgeno de interés presente en la muestra.
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