Debido a su sencillo y rápido procedimiento, los inmunoensayos ELISA son uno de los más utilizados en investigación y diagnóstico para la identificación y/o cuantificación de analitos de naturaleza proteica como péptidos, proteínas, anticuerpos y hormonas.
En función de la manera en que se produzcan las interacciones antígeno-anticuerpo, los ensayos ELISA pueden clasificarse en cuatro principales categorías.
Con esta entrada iniciamos una serie de 3 publicaciones donde os contaremos los detalles sobre los distintos tipos de ELISA, las diferencias entre ellos y las ventajas y desventajas de cada uno.
¡Empezamos!
Como ya hemos comentado en la introducción, en base al modo en el que se den las interacciones antígeno-anticuerpo, los ELISAs se clasifican en 4 tipos: ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA tipo sándwich y ELISA competitivo.
Veamos cada uno de estos tipos de ELISA con más detalle:
El ELISA directo es el ensayo ELISA más simple y rápido de todos, donde un anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá directamente al antígeno de interés permitiendo la detección y/o cuantificación del mismo.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El antígeno se inmoviliza sobre una placa
2º Se añade un anticuerpo primario marcado con una enzima que se unirá al antígeno de interés
3º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
Es un ensayo parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar la señal obtenida. En este caso se utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario, y es este último el que irá conjugado a una enzima.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El antígeno se inmoviliza sobre una placa
2º Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés
3º Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario
4º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
En el ELISA tipo sándwich el antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura y otro de detección también conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a dos epítopos distintos de un mismo antígeno.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la placa
2º Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al anticuerpo de captura
3º Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su vez al anticuerpo de captura.
4º En caso de que el anticuerpo de detección vaya conjugado a una enzima, procederemos directamente con el 5º paso. En caso contrario (que es lo más habitual en los ELISA tipo sándwich), será necesario añadir un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo de detección.
5º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
El ELISA competitivo es una variante más compleja de la técnica ELISA, también conocido como ELISA de inhibición debido al uso de un antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo primario.
Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antígenos presentes en muy bajas cantidades.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
2º Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-anticuerpo
3º Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo
4º Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles
5º Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia.
6º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de interés presente en la muestra.
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